SEC-RP二维液相色谱技术对抗体药Actemra的高效表征
二维液相色谱技术在抗体药Actemra高效表征中的应用
二维液相色谱分离技术，通过利用两根性质不同的色谱柱对复杂样品进行分离，广泛应用于抗体药物领域。在Actemra的表征中，该技术通过一维亲和色谱结合二维排阻色谱（SEC）或反相色谱（RP）串联质谱法，评估抗体的滴度、关键结构特征，如聚集体、片段、电荷异质体、分子量、氨基酸序列和糖基化。
中心切割二维液相方法和全二维液相方法在指导抗体药和生物类似药研发过程中的单克隆筛选方面发挥了关键作用。一维使用亲和色谱方法，二维使用SEC、阳离子交换（CEX）或RP串联质谱法，可以评估抗体药的滴度和关键结构特征。例如，Yi Li等人使用中心切割二维液相方法分析ADC药物中的未偶联小分子相关杂质，该方法的一维是SEC，将ADC药物和未偶联小分子相关杂质分离；然后使用中心切割的方式，将一维的未偶联小分子相关杂质切割到第二维RP串联质谱中，进行在线除盐、杂质鉴定并测定含量。该方法能准确检测并定量分析杂质，回收率在95%-105%，线性均达到0.9999。
在Actemra的高效表征中，采用SEC-RP串联质谱的二维液相色谱技术。首先，通过一维的SEC色谱柱测定Actemra的聚集体、主峰、片段含量。由于一维使用流动相是质谱不兼容的盐，样品在进行二维分析前需进行中心切割，将各个峰切割到loop环中，然后使用二维质谱兼容的流动相将loop环中的馏分冲到二维RP色谱柱中进行除盐并洗脱目标物进入质谱检测器。该技术能够准确、高效地表征Actemra的结构特征。
实验采用的仪器配置包括Thermo Scientific™ Vanquish™ Flex 系列液相色谱、Thermo Scientific™ Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™ 质谱仪和Thermo Scientific™ BioPharma Finder™ 软件。一维色谱条件包括使用室温下的SEC色谱柱，进样量为2 μl，流速为0.15 mL/min，流动相为100 mM PB+100 mM NaCl，pH为7，使用280 nm紫外检测器。二维色谱条件则包括使用MAbPac™ RP色谱柱，柱温为60℃，紫外检测器也设置为280 nm，流动相为流动相A（0.1%FA-H2O）和流动相B（0.1%FA-ACN），流动相梯度表见图2。质谱参数设置根据实验需求进行。
实验结果表明，通过一维SEC-HPLC分析，Actemra样品的主峰含量为97.0%，片段1含量为2.0%，片段2含量为0.2%。主峰的去卷积结果显示，根据已知氨基酸序列进行数据处理，得到相应的分子量和糖型修饰信息。片段1的分子量约为100 KD，推测由两条重链组成，具体还需通过肽图进一步鉴定。片段1的去卷积结果显示相邻分子量均相差约162 Da，推测是相差一个糖修饰。片段2的分子量约为47 KD，具体还需通过肽图进一步鉴定。这些信息对于Actemra的结构特征评估至关重要。
综上所述，二维液相色谱技术在Actemra的高效表征中展现出强大的应用潜力。通过一维SEC分离聚集体、主峰、片段，然后利用二维RP色谱进行除盐并洗脱目标物至质谱检测，能够快速、准确地获得抗体药物的结构特征信息，包括聚集体、主峰、片段的含量，以及分子量和糖基化情况。这一方法适用于抗体药物研发的单克隆筛选及后续稳定性研究质控，为药物质量控制和安全性评估提供有力支持。
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